00 CAMPUS ARISTÓTELES CALAZANS SIMÕES (CAMPUS A. C. SIMÕES) IQB - Instituto de Química e Biotecnologia Dissertações e Teses defendidas na UFAL - IQB
Use este identificador para citar ou linkar para este item: http://www.repositorio.ufal.br/jspui/handle/riufal/1908
Tipo: Dissertação
Título: Avaliação da interação da ovalbumina, principal alérgeno natural da clara de ovo, com sulfonamidas através de estudos espectroscópicos e de atividade biológica
Título(s) alternativo(s): Evaluation of the interaction of ovalbumin, main natural allergy of egg white, with sulfonamides through spectroscopic studies and biological activity
Autor(es): Lyra, Ana Carolina Fradique de
Primeiro Orientador: Santos, Josué Carinhanha Caldas
metadata.dc.contributor.advisor-co1: Figueiredo, Isis Martins
metadata.dc.contributor.referee1: Gomes, Francis Soares
metadata.dc.contributor.referee2: Cardoso, Silvia Helena
Resumo: A interação da ovalbumina (OVA) com quatro sulfonamidas, nomeadamente sulfatiazol (S1), sulfaquinoxalina (S2), sulfadimetoxina (S3) e sulfametazina (S4) foi investigada empregando técnicas espectroscópicas (fluorescência molecular, UV-vis e RMN 1H) simulando as condições in natura do ovo. Para o estudo de interação, explorou-se a fluorescência intrínseca da proteína (λex = 280 nm / λem = 336 nm) na ausência e presença dos ligantes (SFs). As titulações espectrofluorimétricas da OVA (2 μM) com os diferentes ligantes (0-200 μM) foram realizadas em pH 7,4 (tampão Tris 50 mM, NaCl 100 mM). Na avaliação do processo de interação notou-se diminuição na intensidade da emissão da fluorescência da OVA à medida que os excessos das SFs foram adicionados, devido ao processo de transferência de energia (quenching). Por meio destes resultados foi possível calcular a constante de Stern Volmer (Ksv), constante de ligação (Kb) e proporção estequiométrica (n). Os valores de Kb variaram de 3,98 a 27,4x105 L mol-1 (30 ºC) e a partir destes dados observou-se que a magnitude da interação seguiu a seguinte ordem: S1 > S2 > S4 > S3. O número de sítios de ligação em todas as condições foi próximo à unidade. Para todas as SFs avaliadas o aumento da temperatura levou a diminuição dos valores de Ksv e Kb, indicando que o mecanismo de quenching preferencial é estático, com formação de complexos supramoleculares não-fluorescentes. Este resultado foi confirmado pelos estudos de UV-vis com formação do complexo no estado fundamental. Quanto aos parâmetros termodinâmicos, obteve-se ΔG < 0 para todas as SFs avaliadas, indicando que a interação é termodinamicamente espontânea. Para S2 e S3, as forças predominantes na interação são ligações de hidrogênio e forças de Van der Waals, enquanto que para S1 e S4 as forças preferenciais foram eletrostáticas. Através dos estudos por fluorescência 3D observou-se a redução na intensidade de fluorescência dos picos 2 e 3, relativos à emissão dos resíduos de tirosina e triptofano e emissão associada a estrutura secundária da proteína na presença das SFs, respectivamente. Este resultado indica que houve mudanças na estrutura nativa da proteína. Por meio de fluorescência sincronizada foi possível inferir que a interação com a OVA expõe os resíduos de triptofano e tirosina aumentando a polaridade do microambiente destes aminoácidos. Através de estudos baseados em FRET (Fluorescence resonance energy transfer), foi possível calcular a distância intermolecular entre as SFs (receptoras de energia) e a OVA (doadora de energia), as quais foram inferiores a 10 nm. Os estudos de competição com a sonda ANS que monitora regiões hidrofóbicas da proteína indicaram que S2 foi a única sulfa capaz de deslocar este marcador. Já com os íons metálicos, observa-se que Ca(II), Mg(II) e Fe (III) favorecem a interação das sulfonamidas (S1 e S2) com a OVA. A partir dos estudos por ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN 1H) verificou-se deslocamento dos sinais para os hidrogênios aromáticos presentes em S2 e S3. Além disto, foi verificado que a ovalbumina in natura (obtida da clara do ovo) interage com as SFs em maior magnitude quando comparado com a OVA comercial. Por meio de estudos biológicos constatou-se que a E. Coli e B. megaterium são sensíveis as sulfonamidas testadas e que os valores de MIC destes antibióticos na ausência e presença da OVA não diferem. Dessa forma, os resultados obtidos indicam que houve interação entre as SFs e a macromolécula e, consequentemente, mudanças conformacionais na estrutura da proteína foram identificadas. Logo, a presença das SFs em alimentos pode apresentar um risco a segurança alimentar, pois uma vez que há mudança conformacional na cadeia polipeptídica da OVA, esta pode comportar-se como um corpo estranho no organismo e causar/potencializar reações alérgicas.
Abstract: The interaction between ovalbumin (OVA) and four sulphonamides named sulfathiazole (S1), sulfaquinoxaline (S2), sulfadimethoxine (S3) and sulfamethazine (S4) was investigated employing spectroscopic techniques (molecular fluorescence, UV-Vis and 1H NMR) emulating in natura egg conditions. For the interaction study, the intrinsic fluorescence of the protein (λex = 280 nm / λem= 336 nm) was explored in the ligand’s presence and absence (SFs). The OVA spectrometric titrations (2 μM) with different ligands (0-200 μM) were performed in pH 7.4 (Tris-HCl buffer solution 50 mM, NaCl 100 mM). For the evaluation of the interaction process, it was noticed a decrease in the OVA fluorescent emission as SFs excess was added, due to an energy transfer process (quenching). By using these data, the Stern Volmer constant (Ksv), binding constant (Kb) and stoichiometric ratio (n) were calculated. The Kb values ranged from 3.98 to 27.4 x 105 L mol-1 (30 ºC) and by applying these information, it was observed that the interaction magnitude followed the order: S3 < S4 < S2 < S1. The number of binding sites in every condition applied was close to one. For all SFs evaluated the increase in temperature lead to a decrease in both Ksv and Kb values, indicating that the static quenching mechanism is preferable, with the formation of a non-fluorescent molecular complexes. This result was further confirmed by UV-Vis studies with formation of a fundamental state complex. According to thermodynamic parameters, ΔG < 0 was obtained for all SFs evaluated, indicating that the interaction is thermodynamically spontaneous. For S2 and S3, the main forces acting in the interaction are hydrogen bonds and Van der Waals forces, whereas S1 and S4 have electrostatic forces, predominantly. Through 3D fluorescence studies, it was observed a decrease in the fluorescence intensity of peak 2 and 3, which is related to the tyrosine and tryptophan residue emissions associated with the protein secondary structure in the presence of SFs, respectively. This result indicates that there were conformational changes in the protein native structure. By using synchronized fluorescence, it was possible to deduce that the interaction with OVA exposes the tyrosine and tryptophan residues, increasing the polarity of the micro–environment of those amino acids. Through studies based on FRET (Fluorescence resonance energy transfer), it was possible to calculate the intermolecular distance between the SFs (energy acceptors) and OVA (energy donor), which were smaller than 10 nm. The competition assay with ANS probe, which control the protein hydrophobic regions, indicates that only S2 was capable to shift this marker. Metallic ions were also evaluated and it was observed that Ca(II), Mg(II) and Fe(III) can facilitate the interaction between sulphonamides (S1 and S2) and OVA. The 1H NMR studies showed a signal shift for aromatic hydrogens present in S2 and S3. In nature ovalbumin (from egg white) interacts more effectively with SFs than commercial ovalbumin. Biological studies have shown that E. coli and B. megaterium are sensitive to the sulfonamides tested and the MIC values of these antibiotics in the absence and presence of OVA do not present significant difference. This way, the results indicate that there was interaction between SFs and macromolecule and, thus, conformational changes in the protein structure were identified. So, the presence of SFs in aliments shows a risk to food security, since the OVA has its polypeptide chain modified and can act/treat as a foreigner and cause allergic reactions.
Palavras-chave: Ovalbumina
Sulfonamidas
Atividade microbiana
Espectroscopia
Ovalbumin
Sulfonamides
Spectroscopy
Microbial activity
CNPq: CNPQ::CIENCIAS EXATAS E DA TERRA::QUIMICA
Idioma: por
País: Brasil
Editor: Universidade Federal de Alagoas
Sigla da Instituição: UFAL
metadata.dc.publisher.program: Programa de Pós-Graduação em Química e Biotecnologia
Citação: LYRA, Ana Carolina Fradique. Avaliação da interação da ovalbumina, principal alérgeno natural da clara de ovo, com sulfonamidas através de estudos espectroscópicos e de atividade biológica. 2017. 83 f. Dissertação (Mestrado em Química e Biotecnologia) - Instituto de Química e Biotecnologia, Programa de Pós-Graduação em Química e Biotecnologia, Universidade Federal de Alagoas, Maceió, 2017.
Tipo de Acesso: Acesso Aberto
URI: http://www.repositorio.ufal.br/handle/riufal/1908
Data do documento: 21-jul-2017
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